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共培养迁移实验--周细胞与肺微血管内皮细胞共培养迁移试验
koster / 2022-03-16

周细胞生长在血管内皮细胞外周,能够辅助血管的成熟。周细胞的缺失能够直接影响血管的形成。但在肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension (PAH))患者肺组织内的内皮细胞与周细胞之间的关联而导致的血管损伤的机理却尚未清楚。


斯坦福的科研人员在研究周细胞(pericytes)和肺血管内皮细胞(PMVECs)关系时,希望能观测到周细胞和PMVECs共培养时,周细胞收到PMVECs细胞的影响而产生的迁移和极化行为。但在传统的实验中,研究人员只能发现周细胞对PMVEC细胞有一趋化行为。但是无法量化这一趋化行为,也无法研究周细胞的极性变化。


SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.

Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J.

Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899


在文中,研究人员使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了这一共培养“伤口愈合”实验。这是一种双孔的硅胶插件,可以放在培养皿中,插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将两种细胞分别种在插件的两个孔中,等待细胞贴壁长满后,将插件移除,这样,两孔间的缝隙就是一个无细胞的“划痕”。不仅能够观测到周细胞向内皮细胞迁移的行为,而且可以使用细胞免疫荧光染色的方法,对周细胞内的细胞骨架排列进行观测,确定细胞的一个趋化行为。



一,实验材料


1) 细胞:    PMVECs      (C-12282,PromoCell)Pericyte


2) 实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176)


3) 细胞培养基:  EC-media   (C-22120, PromoCell)


                 Pericyte media (ScienCell Research Laboratories)


4) 灭菌镊子


5) 试剂:中性粒周蛋白    (ab4448, Abcam)


             鬼笔环肽        (Invitrogen)


二,实验步骤

1)铺细胞(图二)

  • 将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。

  • 在ibidi细胞插件的每孔中分别加入1.5 × 104的PMVECs和Pericyte的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。

  • 在37℃培养箱中孵育。


图二,ibidi伤口愈合插件中加入细胞


2)形成“划痕”

  • 采用无血清培养基饥饿细胞16小时

  • 如图四所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。


图三,移除插件


  • 移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。

  • 小心的清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养(图四)



三,采集并分析图像

  • 在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像,“划痕”的方向最好是水平或者垂直。

  • 采集0h和6h的图像,观测细胞的迁移率和细胞迁移方向。

  • 用中性粒周蛋白定位微管生长中心(MTOC)并用鬼笔环肽标记F-actin。


由图可见,相对于左侧的对照,右边的PAH来源的Pericytes迁移距离较短,并且从荧光标记图上可见,红色箭头表示迁移的方向,PAH组无特定方向,不受PMVEC的影响。柱状图为统计结果。


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